案例解读 | 单细胞测序解析斑马鱼造血和肾细胞异质性

摘要

在本研究中，使用大规模平行的单细胞RNA测序来定义斑马鱼肾脏内的细胞异质性，构建了在成年斑马鱼中已经发现的造血细胞和功能不同的肾脏细胞的综合分子图谱。通过使用smart-seq、InDrop这两种单细胞测序方法分析血液和肾脏细胞，表征了含DNA蛋白激酶催化亚基（prkdc）或白介素-2受体 γ a（il2rga）的单纯合突变斑马鱼，以及双纯合突变斑马鱼中的免疫细胞缺陷，从而确定特定基因突变体中T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的损失。通过分析还发现了新的细胞类型，包括两类自然杀伤性免疫细胞、由红细胞系启动的造血干/祖细胞，分泌黏蛋白的肾细胞以及肾干/祖细胞。

材料与方法

1、斑马鱼：标记了不同血细胞类型的荧光转基因品系，包括：

（1）Tg(Runx1+23:GFP)：标记了HSPC（造血干/祖细胞）

（2）Tg(cd41:GFP)：同时标记了HSPC和血小板

（3）Tg(mpx:GFP)：标记了嗜中性粒细胞

（4）Tg(rag2:GFP)：标记了源自骨髓的B细胞

（5）Tg(lck:GFP)：标记了胸腺T细胞

（6）rag1缺陷鱼Tg(lck:GFP)：缺乏成熟T细胞，保留GFP NK细胞

2、Smart-Seq2单细胞RNA测序

从转基因斑马鱼中分离出肾脏和胸腺，制成单细胞悬液。然后将单个细胞通过FACS分选到96孔板中。每个孔含有5μl TCL缓冲液+ 1％巯基乙醇。将96孔板在4℃以1000g离心3分钟，在干冰上速冻，并在80℃保存。使用Smart-Seq2方案在单个细胞上进行全转录组扩增和文库构建。

3、InDrops测序

从斑马鱼中分离出骨髓作为单细胞悬液，并用于微流体分选和文库构建：

将肾细胞悬浮液以0.2~106个细胞/ ml的浓度重悬于1x PBS + 1％BSA中，用15％细胞分离液Optiprep处理，并加载到微流体分选装置上。在微流体分选过程中，将单个细胞捕获到液滴中，进行裂解，并使用独特的Barcode反转录RNA，从而可以通过对单个细胞进行独特的分子识别，定量来测量绝对转录水平。

结果与讨论

1、使用smart-seq2单细胞测序对已知转基因品系血细胞进行分析

在六个转基因品系中分析了246个单细胞，通过跨转基因品系差异表达分析，发现已知的细胞谱系特异性基因，它们在每个转基因品系的大部分分离的血细胞中均高度表达（如图1、2所示）。

图1：在荧光转基因品系中表达已知的谱系特异性基因

图2：热图显示了每个转基因品系中前30个高度表达的基因的聚类

用tSNE来可视化单个细胞之间的转录差异。如图3所示，发现来自相同转基因谱系的单个细胞在很大程度上聚集在一起。例如mpx：GFP中性粒细胞。相比之下，来自cd41：GFP和Runx1+23：GFP 的细胞未能聚类到一个确定的组中，这可能反映了转基因标记的细胞内的广泛且不可预测的异质性。

通过拟时分析，如图4、5所示，结果表明，斑马鱼、小鼠和人共享的血细胞层次结构，具有高度的进化保守性。即HSPCs可能是血统确定的，并且成年骨髓中的一部分造血干细胞可以直接指定红系细胞类型。

图3：tSNE聚类分析

图4: 拟时分析

图5: 代表性基因的表达

2、使用InDrops RNA测序对全肾骨髓细胞进行分析

通过对单细胞基因表达的分析确定了成年斑马鱼骨髓中的各种预期的和新的血细胞类型（如图6、7、8所示）。发现存在一种新型的NK样细胞群（NKL细胞），它们并不是来源于lck：GFP淋巴细胞，而是保留了在细胞毒性和裂解细胞类型中表达的基因。

图6：分层聚类确定细胞谱系

图7：根据基因特征鉴定造血细胞类型

图8：在T / NK细胞群体中鉴定出三个亚群

图9：热图表示每种血细胞谱系的高表达基因

3、使用InDrops测序表征突变斑马鱼中的造血细胞缺陷

如图10所示，prkdcD3612fs突变体鱼类的测序结果（3201个细胞），显示B细胞减少了20倍，而T细胞的百分比仅降低了一半。prkdc缺乏会特异性地减少成熟T细胞和NK细胞的数量，而NKL细胞则保留在prkdcD3612fs突变鱼中。

il2rgaY91fs突变斑马鱼的测序结果（2068个细胞），显示T和NK细胞谱系显著减少，而B细胞却没有明显减少。实际上，il2rgaY91fs突变鱼类中B细胞的百分比相对于其他造血群体有所增加，这很可能是由于谱系补偿和淋巴样前体进入B细胞谱系而引起的。

prkdcD3612fs，il2rgaY91fs双纯合突变斑马鱼的测序结果（2276个细胞），显示T、NK和B细胞群体均显著损失。总的来说，这是一种可靠而有效的方法，可以识别突变斑马鱼中的造血细胞缺陷，将来可以用于表征更广泛的突变株。

图10：野生和突变斑马鱼的tSNE分析

4、以单细胞分辨率解剖肾细胞

如图11所示，发现了以前未进行转录分析的新肾细胞谱系，确定了长期推测但分子尚不确定的分泌粘蛋白的肾细胞，使用基因集富集分析（GSEA）发现了肾干/祖细胞、多纤毛细胞和血管内皮细胞的显着基因特征（图12），所有上述鉴定的肾细胞类型也表达了预期的细胞谱系定义基因（图13），从而为研究细胞类型特异性在调节肾脏生长、再生和造血干细胞的作用提供了新的支持。

图11：tSNE分析（左），对野生型和突变型骨髓中发现的已鉴定肾细胞群体的定量（右）

图12：基因集富集分析确定了肾脏祖细胞，多纤毛细胞和血管内皮细胞的上调途径

图13：热图表示指示每个肾细胞谱系的高表达基因

总结

本研究使用Smart-Seq2和InDrops RNA测序方法，以大规模平行的单细胞RNA测序来定义成年斑马鱼骨髓和肾细胞的单细胞异质性，提供了大量的资源来鉴定新型细胞类型和基因表达特征，可用作定义斑马鱼特定细胞谱系的标记。当结合使用免疫组织化学，荧光原位杂交（FISH）或转基因方法研究亚细胞定位信息时，本研究确定的谱系限制性基因将有助于在空间上绘制成年人血液和肾脏细胞类型。这在绘制与造血干细胞相互作用的血管上皮细胞类型中特别适用。

随着测序成本的不断下降以及开发出可在单个细胞内进行更深层次转录谱分析的新方法，可以设想未来的研究将以更高的分辨率来定义血液和肾脏细胞异质性。

本文作者介绍

张汉虞，联川生物单细胞事业部主力人员，负责组织解离和单细胞悬液制备等相关工作，实验技能满点，解离过上百种样本，经验丰富，可至全国各地进行上门解离工作。

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